數(shù)字PCR (digital PCR, dPCR)是在普通PCR和定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的第三代PCR技術(shù)，通過有限稀釋和泊松分布統(tǒng)計實現(xiàn)**的**定量檢測。相比于前兩代PCR技術(shù)，dPCR能夠?qū)崿F(xiàn)DNA模板的**定量且對PCR抑制劑具有更強的耐受性。目前，該技術(shù)在致病菌和病毒、基因突變、甲基化DNA、轉(zhuǎn)基因成分和食品摻假的檢測中都得到了廣泛的應(yīng)用。
PCR技術(shù)的發(fā)展
近年來，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，尤其是基于PCR衍生出的一系列技術(shù)，因其具有操作簡單、快速準確、特異性強且靈敏度高的特點，己被廣泛應(yīng)用于各種檢測領(lǐng)域。1983年，美國KB Mullis教授發(fā)明了PCR技術(shù)用于核酸檢測，其被稱為**代PCR。隨后PCR技術(shù)出現(xiàn)井噴式發(fā)展，1992年科學(xué)家們在**代PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上引入熒光化學(xué)物質(zhì)，發(fā)明了定量PCR技術(shù)(quantitative PCR, qPCR)：通過熒光信號的變化對整個PCR過程進行實時監(jiān)控，*后通過循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)和標準曲線對待測樣本進行定量檢測。數(shù)字PCR (digital PCR, dPCR)技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用于檢測的第三代PCR技術(shù)。區(qū)別于qPCR依賴校準曲線對靶基因定量的策略，該技術(shù)通過將PCR體系分散成無數(shù)個小體積的反應(yīng)單元進行擴增，允許單拷貝DNA的檢測，可以實現(xiàn)對核酸的**定量。每個小反應(yīng)單元含有少量或者沒有目標序列，這有助于降低樣本中的多種抑制劑的干擾和PCR體系中模板之間的競爭效應(yīng)。表1總結(jié)了三代PCR技術(shù)的特點及其應(yīng)用范圍。
數(shù)字PCR的原理
dPCR的原理是通過有限稀釋將含有目的DNA的PCR反應(yīng)體系分散成無數(shù)個單一模板的PCR體系進行擴增，再通過統(tǒng)計檢測結(jié)果及泊松分布校正實現(xiàn)目的DNA的**定量(圖1)。
dPCR包括三個步驟：分散體系、PCR擴增和信號檢測。通過樣品的稀釋和分散形成分散體系，這一步是限制dPCR發(fā)展應(yīng)用的一個重要因素，其所引起的分散數(shù)量和分散體積的不同極大地影響著定量結(jié)果的精度與準確性。分散體系的形成增加了靶分子的有效濃度，并在一定程度上對存在干擾的復(fù)雜化合物進行了純化，提高了靶分子和背景之間的比率％?；赿PCR統(tǒng)計的定量方式，反應(yīng)體系的分散數(shù)量越多，低濃度靶分子的檢測可能性就越大，檢測靈敏度就越高，同時多個單一的反應(yīng)單元也為多目標序列的高通量檢測的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。此外，分散體積的不同會對拷貝數(shù)結(jié)果的測量產(chǎn)生影響，是造成dPCR精度下降的一個潛在因素，且與檢測限的大小形成反比關(guān)系。
目前己成功應(yīng)用于商業(yè)化的dPCR系統(tǒng)根據(jù)分散方式的不同可分為三種主要類型：基于油包水微滴生成技術(shù)的微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、基于微孔芯片的微孔板數(shù)字PCR (micro-chamber digital PCR, mdPCR)和基于微流控技術(shù)的微流控芯片式數(shù)字PCR (microfluidic chip digital PCR, mcdPCR)。另外，基于水凝膠珠、瓊脂糖珠和生物打印技術(shù)等樣本分散方式的dPCR雖然尚未商業(yè)化，但在現(xiàn)有的實驗研究中己取得一定進展。微滴式通過油包裹PCR體系形成無數(shù)個油包水微滴，每個微滴是一個獨立的反應(yīng)單元，這種特殊的微滴在進行PCR時能夠保證完整的形態(tài)，不會互相擴散，也阻止PCR混合物液滴在熱擴增過程的蒸發(fā)；微孔芯片式是利用光刻技術(shù)在硅基上刻蝕出微孔陣列，再通過表面改性、打磨等操作形成數(shù)萬個納升級的表面疏水和孔內(nèi)壁親水的微反應(yīng)室；微流控芯片式則是利用微流控芯片裝置使PCR反應(yīng)體系準確快速地分散于芯片孔中，而每個孔都是一個小反應(yīng)體系(納升級)。
雖然基于微流控技術(shù)的微滴生成方法已經(jīng)成熟，但是其技術(shù)本身帶來的高昂成本以及復(fù)雜的轉(zhuǎn)液手工操作使用戶苦不堪言。振動注射技術(shù)的研發(fā)初衷就是要開發(fā)出全自動化，低成本，高可靠性的微滴生成方法。思納福（sniper）振動注射技術(shù)的核心是一個特制的加樣槍頭。槍頭浸入油相中，水相反應(yīng)液勻速排出槍頭，在進入油相的過程中，槍頭前端進行勻速的擺動，從而產(chǎn)生均一的微液滴。采用振動注射技術(shù)，一方面可以通過控制流速，振動頻率來靈活調(diào)整微滴體積的大小，另一方面該方法可以直接整合到自動化加樣工作站流程中，無需昂貴的微流控耗材，能夠直接在多孔板中生成微滴，在低成本的同時實現(xiàn)了液滴生成全流程的自動化。同時，振動注射技術(shù)對油相粘度不敏感，無需特殊的溫控環(huán)境就能夠產(chǎn)生均一可控的微滴。
關(guān)于信號檢測，目前主要有光電倍增管(photomultiplier，PMT)、桂光電子計數(shù)器(multi-pixelphoton counter, MPPC)、電荷稱合器件(charge-coupled device, CCD)、互補金屬氧化物半導(dǎo)體(complementary metal oxide semiconductor, CMOS)、掃描器等5種高分辨率的圖像處理策略。
dPCR定量計數(shù)的方法相較于傳統(tǒng)qPCR的定量方法更為簡單，無需建立標準曲線和計算反應(yīng)的擴增效率等繁瑣步驟，而是通過直接計數(shù)的方式得出檢測結(jié)果。根據(jù)陽性信號數(shù)量進行統(tǒng)計計算時，所得的*終結(jié)果不是真實的目標DNA分子拷貝數(shù)存在著一定的可能性，因此需要通過泊松分布概率公式對反應(yīng)的結(jié)果進行校正計算。
數(shù)字PCR在生物學(xué)檢測中的應(yīng)用
dPCR發(fā)展至今己近20年，因其具有檢測靈敏度高、特異性強且有效避免PCR抑制劑的影響等優(yōu)勢，在分子檢測和疾病診斷等領(lǐng)域都得到了廣泛應(yīng)用。尤其是近幾年隨著dPCR儀器的不斷開發(fā)，有大量的研究報道進一步證實了dPCR的優(yōu)勢。
?致病菌的檢測
致病菌，是導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生的主要原因。通過設(shè)計致病菌的靶基因序列的特異性引物和進行擴增是應(yīng)用PCR技術(shù)實現(xiàn)檢測的主要原理。dPCR作為第三代PCR技術(shù)，提高了檢測的靈敏度和準確性，減少了前期的增菌培養(yǎng)過程，大大縮短了檢測分析的時間，而且不需要建立標準曲線即可實現(xiàn)對目標分子的**定量檢測。
?病毒的檢測
目前病毒檢測常用的方法主要是通過免疫學(xué)方法檢測其蛋白質(zhì)或通過分子生物學(xué)方法檢測其特定核酸。dPCR作為**的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，檢測時無需建立標準曲線且不受基質(zhì)效應(yīng)的影響，適用于病毒分子定量檢測尤其是低拷貝病毒的定量檢測。
?基因突變的檢測
基因突變的檢測方法主要是PCR或Sanger測序法，但這兩種方法對低含量的基因突變檢測靈敏度低，且難以滿足早期突變篩查的需要。dPCR**次被闡述正是用于基因突變的檢測，結(jié)果顯示dPCR對基因突變的分析靈敏度高，且可以對復(fù)雜組織進行檢測。
?甲基化DNA的檢測
有研究表明，啟動子高甲基化與一些關(guān)鍵腫瘤抑制基因的沉默有關(guān)，并且這種甲基化通常發(fā)生在癌變的早期階段，所以甲基化DNA檢測被認為是癌癥檢測和診斷的重要手段。目前，甲基化DNA的檢測方法己有大量文獻報道，其中基于限制性核酸內(nèi)切酶的一類方法通常與PCR技術(shù)聯(lián)合使用，而dPCR作為**的PCR技術(shù)在甲基化DNA的檢測中也得到了廣泛應(yīng)用。
?細胞及基因治療方向的應(yīng)用
數(shù)字PCR在細胞及基因治療方向的應(yīng)用包括病毒載體滴度（例如：被用于定量制品中慢病毒載體滴度、AAV載體滴度、腺病毒載體滴度等），基因轉(zhuǎn)導(dǎo)檢測（例如：用于測量整合到誘導(dǎo)多能干（iPS）細胞、CD34 +造血干細胞、T細胞中的逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒載體的拷貝數(shù)）及基因治療制品中污染物檢測等。
?轉(zhuǎn)基因作物及食品摻假成分的檢測
近年來，轉(zhuǎn)基因食品飽受爭議，準確靈敏的檢測方法對轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)控尤為重要。GB/T19495系列標準將qPCR作為檢測轉(zhuǎn)基因作物的金標準，但是qPCR在檢測轉(zhuǎn)基因成分基質(zhì)復(fù)雜的作物時會造成偏差，使檢測的結(jié)果不準確，而且還容易對低濃度的轉(zhuǎn)基因樣品造成漏檢。而dPCR作為第三代PCR技術(shù)，由于其在低豐度檢測和強耐受抑制劑方面的優(yōu)勢，應(yīng)用dPCR對轉(zhuǎn)基因作物進行檢測也受到了廣泛的關(guān)注。
思納福醫(yī)療科技有限公司（Sniper）成立于2018年4月，以微液滴技術(shù)為根基，專注于下一代精細化分析醫(yī)療儀器的研發(fā)。團隊來自于北京大學(xué)，北京航空航天大學(xué)等知名高校和企業(yè)，曾從事高端科研設(shè)備的定制化服務(wù)，客戶覆蓋航天、核能、醫(yī)療、新材料等領(lǐng)域，積累了豐富的新技術(shù)工程化和量產(chǎn)化經(jīng)驗。團隊開發(fā)了具有全球化自主知識產(chǎn)權(quán)的微滴生成方法——振動注射技術(shù)（Vibrant Injection）
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Sniper DQ-24 技術(shù)優(yōu)勢：
操作簡單，全自動化一體機
檢測速度快，1.5-2h檢測時長
6色熒光通道
樣本有效利用率高，＞85%液滴有效率
耗材成本低
