得益于HaiGene分子酶進(jìn)化技術(shù)平臺（in silico Design & invitro Evolution Workflow），并持續(xù)聚焦LAMP恒溫擴(kuò)增技術(shù)，HaiGene全新升級的Bst4.2系列，將LAMP擴(kuò)增技術(shù)推入了新的高度。Bst4.2維持了Bst4.0 DNA/RNA通擴(kuò)的能力。在現(xiàn)階段，熱啟動HotStart Bst4.2 Polymerase為已知的LAMP擴(kuò)增*佳用酶。Bst4.2全系包含熱啟動Aptamer，該配體確保酶在<30℃時，酶活封閉效率>95%,在>60℃時1min內(nèi)完全釋放酶活。該特性利于室溫建立反應(yīng)體系，并大幅降低了低溫條件下的非特異擴(kuò)增。并且耐熱性進(jìn)一步提升到70℃。由于擴(kuò)增性能得到質(zhì)的提升，使得LAMP引物篩選難度大幅下降，更易于獲得穩(wěn)定的擴(kuò)增結(jié)果和可靠的終端產(chǎn)品。
熱啟動、低引物用量、全系70℃擴(kuò)增、速度快、高特異性
Bst4.2系列性能優(yōu)勢：
（1）試劑反應(yīng)溫度提升到70℃，提供更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊锱鋵l件，大幅降低了引物Dimer效應(yīng)。在此條件下，引物篩選難度大幅降低，利于研究及開發(fā)人員的引物篩選。除此外，高溫反應(yīng)使得粗樣本的核酸釋放更加充分，易于核酸免提取檢測，且致病菌毒滅活更加充分。 （3）高親和力的HotStart Aptamer確保聚合酶30℃以下，酶活殘留<5%，熱啟動效應(yīng)遠(yuǎn)高于N公司制品。高親和力的Aptamer使得反應(yīng)體系易于建立，并維持均一的擴(kuò)增性能。 （4）全新開發(fā)的L-HNB顯色技術(shù)（Leuco-HNB），解決了HNB反應(yīng)完畢后，顏色對比不明顯的問題。同時保留了HNB對緩沖液、樣品的耐受度的優(yōu)點。該變色方法，適用性遠(yuǎn)優(yōu)于基于pH變色的可視化法。
（2）試劑中加入了HaiGene**開發(fā)的Helicaser（解旋因子），使得“啞鈴”結(jié)構(gòu)底物的形成，可以依靠Helicaser來完成。因此，標(biāo)準(zhǔn)LAMP中的F3/B3引物可以完全移除。同時Helicaser具有協(xié)助解鏈的功能，使得FIP/BIP引物使用濃度進(jìn)一步下降。此項實驗方案由HaiGene測試建立，并命名為eLAMP (Easy LAMP)。
數(shù)據(jù)展示
1、Bst 4.2 HotStart功能展示 采用熒光酶活測定法在30℃和60℃條件下測定HotStart Bst 4.2，結(jié)果顯示與未加入Aptamer的對照比較來看。HotStart Bst 4.2在30℃條件下酶活幾乎無活性，而60℃條件下1min內(nèi)酶活完全釋放，恢復(fù)****活性。
2、以Bst 4.2 SYBR Green試劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)LAMP和eLAMP擴(kuò)增比較
以human Total RNA為模板，采用RnaseP LAMP Primer進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)LAMP和eLAMP 擴(kuò)增。在25ul擴(kuò)增體系中加入10ng、1ng和0ng的RNA，70℃反應(yīng)40min。從擴(kuò)增結(jié)果可獲得，在Helicaser的加持下F3/B3可完全去除，對擴(kuò)增速度幾乎無影響，并且非特異性擴(kuò)增得到改善。6 Primer LAMP引物濃度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM; F3/B3=0.1 μM。4 Primer eLAMP引物濃度：FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM。
3、以Bst 4.2 Basic試劑進(jìn)行DP-eLAMP探針法擴(kuò)增
在眾多的探針法LAMP測試中，DP-LAMP探針法(Displaceable Probe LAMP)為HaiGene推薦的使用方法（參考PMID: 33626039）。在LAMP擴(kuò)增中將LF或LB引物退火至互補的猝滅oligo，利用鏈置換活性獲得游離的熒光信號（可參考HaiGene A3831-21說明書資料）。該方案可進(jìn)一步降低LAMP的非特異擴(kuò)增。下圖為DP-eLAMP進(jìn)行三種熒光標(biāo)記探針的實驗數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示HotStart Bst4.2總能獲得高特異性和高重復(fù)性的擴(kuò)增。
4、以Bst4.2 L-HNB 試劑進(jìn)行L-HNB (紫羅蘭-淡綠) 變色反應(yīng)（肉眼觀察）
以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，采用eLAMP擴(kuò)增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 對10000、1000、100、25copies/管的陽性RNA進(jìn)行檢測，ddH20為陰性對照（4重復(fù)）。下圖為70℃反應(yīng)30min 后的檢測結(jié)果。結(jié)果表明L-HNB法獲得清晰易于區(qū)分的顏色變化，極易區(qū)分陽性和陰性擴(kuò)增。
5、 以Bst4.2 L-HNB (紫羅蘭-淡綠) 變色反應(yīng)對反應(yīng)緩沖鹽Tris的耐受性測試
以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，采用eLAMP擴(kuò)增法（FIP/BIP=0.8 μM; LoopF/B=0.4 μM）, 對1000copies/管的陽性RNA進(jìn)行檢測（2重復(fù)），ddH20為陰性對照（2重復(fù)）。下圖為70℃反應(yīng)30min 后的檢測結(jié)果。結(jié)果表明L-HNB法，在1x濃度下可耐受10mM Tris-HCl的緩沖鹽，陽性樣本仍然可以充分的變色。該變色方法不受樣本中緩沖鹽影響。
6、 以Bst4.2 Red試劑進(jìn)行LAMP紅黃變色擴(kuò)增
以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起始前，下圖為70℃反應(yīng)30min后。
7、 以Bst 4.2 Basic試劑搭配 OG 橙綠變色反應(yīng)管（A3821）
以2019-nCoV體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起始前，下圖為70℃反應(yīng)30min后。
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