本期，我們繼續(xù)聊聊數(shù)字PCR在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用，上期內(nèi)容：
基因突變檢測與治療反應(yīng)監(jiān)測
癌癥相關(guān)基因突變隨疾病進(jìn)展或治療的進(jìn)展而動態(tài)變化，因此基因突變的檢測可以用來監(jiān)測癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。
例如，KRAS基因突變在結(jié)直腸癌和胰腺癌中均有較高的發(fā)現(xiàn)率，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)及患者預(yù)后直接相關(guān)。現(xiàn)有的檢測KRAS突變的方法有Sanger測序、二代測序、ARMS-PCR等，Sanger測序的突變檢測限約為20%；二代測序方法的突變檢測限約為5%；ARMS-PCR方法的突變檢測限在1%左右，而dPCR用于突變檢測的突變檢測限可以達(dá)到0.05%~0.10%，甚至更高（表1）。
表1不同方法學(xué)KRAS基因突變檢測限
文獻(xiàn)案例1：
數(shù)字PCR檢測結(jié)直腸癌患者血漿中 KRAS突變，可作無創(chuàng)生物標(biāo)志物
KRAS 突變是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者對抗表皮生長因子受體治療產(chǎn)生耐藥性的原因。通過數(shù)字PCR檢測血漿cfDNA中的 KRAS 突變（“液體活檢”）已成為一種非常靈敏且有潛力的連續(xù)活檢疾病監(jiān)測的替代方案。
在這項(xiàng)研究中，通過ddPCR分析了10名結(jié)直腸癌患者血漿DNA中的 KRAS G12V突變，并與6名健康供體進(jìn)行了比較。
結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者KRAS 突變?yōu)?5.62copies/mL（中位數(shù)），而在健康對照中僅發(fā)現(xiàn)殘留拷貝（0.62copies/mL，p =0.0066）。轉(zhuǎn)移性疾病患者的血漿KRAS G12V突變拷貝數(shù)明顯高于M0患者（中位數(shù)分別為126.25copies/mL和9.37copies/mL，p =0.0286）。
與健康對照比較，結(jié)直腸癌患者血漿中野生型KRAS和KRASG12V突變的拷貝數(shù)顯著升高。此外，在癌癥轉(zhuǎn)移的情況下，突變拷貝數(shù)會更高，說明KRASG12V突變與預(yù)后相關(guān)，如進(jìn)展差、術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率高、生存期短等。因此該突變可作為監(jiān)測結(jié)直腸癌疾病進(jìn)展的無創(chuàng)生物標(biāo)志物之一，利用ddPCR檢測結(jié)直腸患者血漿中KRASG12V突變是可取的。
文獻(xiàn)案例2：
使用數(shù)字PCR檢測乳腺癌和胃癌患者的HER2擴(kuò)增
人表皮生長因子受體-2基因（HER2，ERBB2）編碼HER2蛋白，該HER2蛋白在正常組織中罕見表達(dá)灶，但是HER2異常擴(kuò)增會導(dǎo)致HER2蛋白在乳腺癌、胃癌和其他腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。
目前，HER2基因表達(dá)檢測被廣泛用作乳腺癌和胃癌患者靶向治療的輔助診斷工具，批準(zhǔn)用于臨床的檢測通常是基于蛋白質(zhì)水平的免疫組織化學(xué)或基因水平的熒光原位雜交，但這些檢測只能用于組織標(biāo)本，無法對腫瘤細(xì)胞的HER2進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。
為了評估該測定與目前臨床使用的測試的總體一致性，招募了206患者，并對每個(gè)樣本的FFPE組織切片進(jìn)行了FISH、IHC和血液樣本數(shù)字PCR檢測。
在206例乳腺癌患者中，68例（33.01%）經(jīng)dPCR鑒定為HER2陽性。對51個(gè)IHC2+樣本進(jìn)行FISH檢測，以確認(rèn)HER2基因是否發(fā)生突變。FISH結(jié)果顯示11例（21.57%）為陽性，其余40例（78.43%）為陰性。乳腺癌FFPE組織樣本中dPCR和IHC/FISH的一致性為96.1%（206例中有198例），敏感性為92.65%（68例中有63例），特異性為97.83%（138例中有135例）（如下表）。
對91例胃腺癌患者進(jìn)行了dPCR和IHC/FISH檢測。結(jié)果顯示，21例（23.08%）被dPCR認(rèn)定為HER2陽性，70例（76.92%）為HER2陰性。IHC確定了19例陽性（20.88%）和60例陰性（65.93%）。其余12例IHC2+胃癌樣本的FISH檢測顯示2例陽性（17%）和10例陰性（83%）。胃癌FFPE組織樣本中dPCR和IHC/FISH的一致性為95.6%（87/91），敏感性為90.48%（19/21），特異性為97.14%（68/70）。
利用dPCR技術(shù)來檢測血液標(biāo)本中HER2基因表達(dá)狀態(tài)，結(jié)果顯示血液標(biāo)本HER2檢測的準(zhǔn)確性與組織標(biāo)本一致性很高，說明通過dPCR檢測血液中HER2表達(dá)水平是一個(gè)非常好的手段，可作為癌癥治療過程中的監(jiān)測工具。
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